悬于低渗裂解缓冲

[jone447]

磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞两次，在冰上刮擦，沉淀，并重液（10 mM HEPES (pH 7.9)、1.5 mM MgCl 2 、10 mM KCl、1 mM DTT、cOmplete TM 蛋白酶抑制剂混合物（Roche）、0.1% NP40）中。将裂解物在冰上孵育 1 分钟，短暂涡旋并在 4 °C 下以 10,000 × g离心 30 秒。收集上清液（细胞质提取物），并将核沉淀重悬于 RIPA 缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8，150 mM NaCl，1% NP40，0.5

% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS 和 1 片 cOmplete TM 无 EDTA 蛋亚洲手机号码列表白酶抑制剂混合物（Roche））中。通过BCA测定(Sigma)测定蛋白质浓度。 单分子荧光原位杂交 对于单分子荧光原位杂交 (smFISH)，将 1 × 10 5原代人肝细胞接种在精密盖玻片 (Marienfeld, 0117580) 上，培养 6 小时直至贴壁，并用指示浓度的辛

伐他汀 (Merck S6196) 处理16 小时。将细胞在 4% 多聚甲醛中固定 5 分钟，洗涤并按先前所述进行 smFISH 74。使用末端脱氧核苷酸转移酶75以 Atto-565 酶促标记针对 ApoB 开放阅读框的探针（补充表 2 ）。使用配备横河 CSU W1-T2 转盘共焦扫描装置、Plan Apochromat 100 × 1.4 NA 油物镜和 sCMOS 相机的 Zeiss AxioObserver7 倒置显微镜进行成像。使用